trilink基因編輯

基因組編輯已成為治療發(fā)展中令人興奮的新領(lǐng)域之一。存在多種用于基因組編輯的工具。簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序列（CRISPR）/ Cas9由于其高效和易用性，已成為受歡迎的基因組編輯工具。Cas9 mRNA與指導RNA的共轉(zhuǎn)染導致雙鏈斷裂，可以通過非同源末端連接（NHEJ）修復，從而導致使目標基因失活的插入缺失。如果與切割位點具有同源性的供體DNA模板也被共轉(zhuǎn)染，則同源性指導的修復可導致基因校正或插入。

TriLink提供了三種類型的Catalog mRNA，用于CRISPR基因組編輯。對于CRISPR / Cas9基因編輯，這些包括具有未修飾堿基的Cas9 mRNA以及經(jīng)5-甲氧基尿苷修飾以減少先天免疫應答的Cas9 mRNA。我們還提供經(jīng)5-甲氧基尿苷修飾的Cas9切口酶。Cas9切口酶具有D10A氨基酸突變，可防止DNA鏈之一的切割。結(jié)果，Cas9切口酶產(chǎn)生單鏈切口，而不是雙鏈斷裂。DNA的切割或編輯通過約100個核苷酸的單個引導鏈RNA（sgRNA）定向到特定的染色體位置。CRISPR的另一種核酸酶是Cas12a。CRISPR / Cas12a基因編輯使用約42個核苷酸的RNA導鏈。TriLink提供未修飾的Cas12a或5-甲氧基尿苷修飾的Cas12a mRNA。 

我們的基因編輯工具中包括Cre重組酶，這是一種酪氨酸重組酶，可催化兩個loxP位點之間的重組。由于Cre介導的重組，兩個都包含loxP位點的獨立DNA物種可能發(fā)生融合事件。Cre可用于將DNA序列插入包含loxP位點的基因組。它也可用于細胞標記研究，其中Cre表達激活了轉(zhuǎn)基因小鼠品系中l(wèi)oxP位點側(cè)翼的無活性報告基因。然后，用Cre mRNA轉(zhuǎn)染的細胞將表達報告基因，并揭示哪些細胞被高效轉(zhuǎn)染。

成簇的規(guī)則間隔的短回文重復序列（CRISPR）迅速成為基因組編輯領(lǐng)域受歡迎的工具。CRISPR已被適配用于細菌抗噬菌體免疫系統(tǒng)的哺乳動物細胞。

TriLink CRISPR工具套件包括兩個組件：一個是由Cas9或Cas12a mRNA編碼的CRISPR核酸酶，第二個是向?qū)NA。實際上，Cas9指南由CRISPR RNA（crRNA）和反式CRISPR RNA（tracrRNA）組成。為了簡化和提高效力，研究人員將這兩個RNA融合為一個約100個核苷酸的單個RNA，他們將其稱為單個向?qū)NA（sgRNA）。與Cas9相比，Cas12a使用約42個核苷酸的單個引導RNA。

當將Cas9或Cas12a mRNA和sgRNA共轉(zhuǎn)染到細胞中時，引導鏈將Cas9或Cas12a蛋白導向基因組中的特定位置，然后在Cas9中產(chǎn)生雙鏈斷裂。Cas9切口酶mRNA編碼具有D10A突變的Cas9，該突變導致單鏈切口而不是雙鏈斷裂。這可能導致較少的脫靶效應。

嵌合抗原受體（CAR）T細胞已被用作血液腫瘤臨床治療的過繼性T細胞療法（ACT）免疫療法之一。近，它們也已經(jīng)應用于實體瘤。

通常對CAR構(gòu)建體進行修飾，使其包含單鏈抗體片段（scFv）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，以及通過獨立于主要組織相容性復合物（MHC）的細胞內(nèi)信號傳導域激活T細胞的能力。修飾的T細胞在細胞表面表達CAR，其在治療期間識別腫瘤相關(guān)抗原。

從要治療的患者中收集大多數(shù)CAR T細胞的原始材料（自體移植）。擴增并修飾收獲的細胞以表達CAR。CRISPR通常用于在TRAC（T細胞受體α常數(shù)）位點特異性插入位點，取代內(nèi)源性T細胞受體。自體移植可避免排斥反應和移植物抗宿主病，但這些細胞通常來自病情較重的患者，因此效力可能不及健康供體所收集的細胞。另一種通用的現(xiàn)成解決方案是使用來自健康，同種異體供體的修飾細胞。這提供了一種途徑來克服高昂的成本，一定程度地減少制造復雜性，縮短治療時間并解決患者健康和生物安全問題。

然而，為了防止這些外源細胞的排斥，需要通過CRISPR進行廣泛的基因缺失。CRISPR-Cas工程提供了下一代CAR T細胞解決方案，可以沉默或破壞任何所需的基因組基因座，使移植物抗宿主病（GvHD）和排斥反應小化，敲除檢查點受體，增強抗腫瘤反應等。今天的CRISPR-Cas工程CAR T細胞在治療感染性疾病，自身免疫性疾病和提高移植耐受性方面具有治療潛力。

TriLink為CRISPR提供了幾種未經(jīng)修飾或經(jīng)5-甲氧基尿苷（5moU）修飾的mRNA，以減少先天免疫應答。在該領(lǐng)域*的研究人員的幫助下，這些序列已進行了序列優(yōu)化，以實現(xiàn)良好表達。TriLink還生產(chǎn)鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應子核酸酶（TALEN）mRNA，用于生產(chǎn)CAR T細胞療法。當您準備將研究成果轉(zhuǎn)移到臨床時，TriLink會在我們的cGMP設施中提供GMP合成的導鏈和核酸酶mRNA。

重組酶

位點特異性重組酶是用于操縱基因組以及有條件地激活或去激活細胞和生物體中基因表達的有用工具。重組酶識別約30-40個核苷酸的短目標DNA序列，并催化定向DNA交換反應。由于識別位點在高等生物的基因組中并不常見，因此可以用作工程改造基因組的工具。然而，重組酶在細胞或體內(nèi)的持續(xù)表達可能會導致毒性和不合需要的脫靶重組。因此，mRNA的瞬時表達是重組酶表達的理想方法。

常用的重組酶之一是Cre重組酶。我們CleanCap ® NLS-Cre重組酶基因是一個上限（第1章）和聚腺苷酸化信使RNA，編碼Cre重組酶融合到核定位序列（NLS）。Cre重組酶是衍生自P1噬菌體的酪氨酸重組酶。Cre催化兩個loxP位點之間的重組，這些位點由一個34個堿基對的識別位點（5'ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT 3'）組成。Cre重組酶已被廣泛用于操縱植物，細菌，酵母和哺乳動物中的DNA。根據(jù)loxP位點的方向，Cre可用于誘導DNA盒交換，切除/插入，倒位和易位。

NLS-Cre重組酶mRNA的應用包括創(chuàng)建敲除或敲入動物，組織特異性蛋白表達以及標記研究，這些研究報道了將mRNA遞送至給定細胞類型。Cre重組酶mRNA也是評估體外和體內(nèi) mRNA遞送效力的有用工具。

人才

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）已經(jīng)成為鋅指核酸酶（ZFN）的一種更容易獲得的替代物。像ZFN一樣，TALENs利用模塊化的DNA結(jié)合基序，可以對其進行修飾以引入新的DNA結(jié)合特異性。與ZFN不同，TALEN不太容易使從頭設計復雜化的序列上下文效應，使它們成為普通科學界更實用的工具。TriLink自定義mRNA轉(zhuǎn)錄服務包括TALEN mRNA。TALEN由多個重復可變雙殘基（RVD）組成，每個重復殘基與單個核苷酸結(jié)合。通過以特定順序?qū)VD串在一起制成TALEN陣列，以提供對新型DNA序列的特異性和結(jié)合親和力。通常，工程化的TALEN序列與非特異性切割結(jié)構(gòu)域融合，例如FokI。與ZFN一樣，TALEN充當與相鄰DNA序列結(jié)合的對。TriLink提供了mRNA表達載體，旨在輕松接受使用Golden Gate方法克隆的TALEN。

轉(zhuǎn)座酶

轉(zhuǎn)座酶是一種以非常準確的方式催化轉(zhuǎn)座子（DNA元件）從基因組中的一個位置移動到另一位置的酶。轉(zhuǎn)座子廣泛存在于人類基因組中，并可能導致多達40％的基因組重排。轉(zhuǎn)座酶是將外源序列插入靶基因組的早可用工具之一。通常，用于轉(zhuǎn)移的序列在轉(zhuǎn)座子盒中側(cè)接反向末端重復序列。當轉(zhuǎn)座子盒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)座酶催化轉(zhuǎn)座子的切除及其插入細胞染色體中。兩種常見的轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Sleeping Beauty和PiggyBac。睡美人轉(zhuǎn)座子整合到基因組的TA序列中，