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| 品牌：Wako CAS No.： 儲存條件：-20℃ 純度：– 質譜級賴氨酰肽鏈內切酶 |
質譜級賴氨酰肽鏈內切酶
Lysyl Endopeptidase
本產品是質譜分析前處理時常用的蛋白分解酶即賴氨酰肽鏈內切酶，該酶可以特異性切除賴氨酸基團C末端的多肽，可用于蛋白測序分析和Lys-X化合物的酶合成。若同時使用賴氨酰肽鏈內切酶和胰酶，可更好地切斷賴氨酸 基團的多肽，增加多肽的數量。產品已按照使用習慣做成小包裝，是方便使用的冷凍干燥品。
來源：細菌
外觀：凍干粉（包含2mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8）
活性：0.03～0.07AU/vial
分子量：27,000(瓊脂糖過濾)，30,000（SDS-PAGE）
溶解性：溶于水或緩沖液
穩定性：溶解于pH值5.0-12.0的Tris緩沖液中，可在4℃穩定保存2年；在pH值6.0-11.0 30℃時能穩定保存，但溫度超過50℃時不穩定。
最適pH值:9.0~9.5
等電點：6.9~7.0
底物特異性：
可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA
不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA
抑制劑：DFP，PMSF，TLCK
◆特點
● 高特異性、高蛋白質消化率、適用于蛋白質譜分析
● 提高裂解效率、增加肽段數量
● 根據使用量特意制備小包裝，方便使用
◆應用
分別采用胰蛋白酶(Tp)、賴氨酰肽鏈內切酶(Lep) 和Tp與Lep聯用進行膠內酶切的效果比較。
牛血清蛋白BSA 的條帶(100ng) 通過SDS-PAGE 獲得，然后分別用Tp、Lep和Lep+Tp進行酶切，再用MALDI-TOFMS法進行分析。
這些蛋白酶的實驗效果見下表。
表 1：Tp、Lep和Lep+Tp的結果對照
這些結果表明Lep酶解的錯誤裂解率低。Tp酶解時加入Lep后，錯誤裂解率有所降低，同時，可以鑒定出更多的多肽。
| Tp | Lep | Lep +Tp | |
| 裂解位點 | 精氨酸和賴氨酸的C端 | 賴氨酸的C端 | 精氨酸和賴氨酸的C端 |
| 錯誤裂解率( 錯誤裂解所占比例 ) | 多(8%) | 很少(0%) | 少(3%) |
| 鑒定出的多肽數量 | 17 | 19 | 22 |
胰蛋白酶 (Tp)( 圖 a) 和賴氨酰肽鏈內切酶 (Lep)+Tp ( 圖 b) 酶切后的質譜結果對照圖。
Lep+Tp酶切后，可以在m/z=2000時得到吸收峰，而單獨的Tp酶切在m/z=2000時沒有吸收峰。該結果表明Lep可以提高測序覆蓋度。
( 數據由大阪醫療中心和婦嬰健康研究所Y. Wada博士提供 )
賴氨酰肽鏈內切酶
賴氨酰肽鏈內切酶，最初由Masaki 等人從土壤細菌中分離得到。該酶可以特異性剪切賴氨酸殘基C 末端和S-氨乙基半胱氨酸殘基的肽鍵，用于蛋白測序和Lys-X 化合物的酶催化合成。該酶穩定性高，在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小時之后，仍然擁有完整的生物活性。
| 外觀 | 凍干粉（包含ca. 10% Tris-HCl buffer，pH 8） | 活性 | 見包裝 |
| 分子量 | 27,000（凝膠過濾）；30,000 (SDS-PAGE) | 溶解性 | 易溶于水或緩沖液 |
| 最佳pH | 9.0-9.5（酰胺酶的最佳活性pH） | 等電點 | 6.9-7.0 |
| 抑制劑 | DFP、PMSF、TLCK | 來源 | 細菌 |
| 穩定性 | 溶于pH 值5.0-12.0 的緩沖液中，可于4℃穩定保存。溶于pH值6.0-11.0的緩沖液中，可于30℃穩定保存，但是50℃及以上不穩定。 | ||
| 單位定義 | 一單位酰胺酶(AU) 指在30℃ pH9.5 時每分鐘產生1μmol對硝基苯胺所需的酶量。 | ||
| 底物特異性 | 水解底物：Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA | ||
| 非水解底物：Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA |
實驗方法：
1. 試劑：
A．0.2 mol/L AMP 緩沖液，pH值9.5
溶解4.2g的2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇于150 mL的水中，加入1 mol/L HCl調pH值至9.5，再加水使體積至200 mL。
B．2.5 mmol/L 底物溶液
溶解22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽于20 mL水中。
C. 2 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8
溶解0.24 mg的2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇于900mL水中，加入0.1 mol/L HCl調pH值至8，再加水使體積至1L。
D. 酶溶液
溶解1vial的賴氨酰肽鏈內切酶于1 mL的溶劑C中，可直接加入。
E．終止溶液
將55 mL水和45 mL乙酸混合均勻。
2. 步驟
| 試劑 | 檢測樣品 | 空白對照 |
| A | 2.6 mL | 2.6 mL |
| B | 0.3 mL | 0.3 mL |
| 30℃預培養5分鐘 | ||
| D | 0.1 mL | – |
| C | – | 0.1 mL |
| 立即混合均勻，30℃預培養25分鐘 | ||
| E | 1.0 mL | 1.0 mL |
3. 單位的定義
酰胺酶單位是指30℃ pH9.5時，每分鐘產生1 umol對硝基苯胺的酶量。
AU/vial = [(a-b) / 25] × (1 / 9.62) × (4.0 / 0.1)
a. 檢測樣品中的吸光度
b. 空白對照中的吸光度
膠內酶切的實驗操作流程
用聚硅酮處理的微量離心管和吸管端防止捕獲任何蛋白。使用質譜分析用凝膠染色試劑盒，例如銀染劑MS試劑盒（產品編號：299-58901）和負凝膠染色MS試劑盒（產品編號：293-57701）
1. 電泳分離蛋白質樣品；
2. 從凝膠中切割蛋白質片斷并放入微量離心管；
3. 使凝膠脫色（可使用質譜分析用凝膠染色試劑盒中的脫色溶液）；
4. 加入300 uL乙腈到試管里，攪拌器振蕩30分鐘；
5. 去除乙腈，用Parafilm膜覆蓋微量離心管。
6. 在Parafilm膜上打出針孔，真空干燥15分鐘；
7. 100 uL 10 mmol/L DTT溶解于100 mmol/L 碳酸氫銨，56℃恒溫1小時。
8. 室溫冷卻后，用等量的50mM碘乙酰胺溶解于100 mmol/L 碳酸氫銨，暗處恒溫45分鐘并渦旋；
9. 用100 uL 100 mmol/L碳酸氫銨洗滌凝膠片段10分鐘；
10. 用300 uL乙腈干燥凝膠片段15分鐘；
11. 用100 uL 100 mmol/L碳酸氫銨溶脹凝膠片段15分鐘；
12. 用300 uL乙腈再次干燥凝膠片段15分鐘；
13. 去除液相，真空干燥凝膠片段15分鐘；
14. 用100 uL賴氨酸內切酶溶液*在冰水浴中溶脹凝膠片段45分鐘；
*賴氨酸內切酶稀釋于50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5；
15. 去除100 uL賴氨酸內切酶溶液，將凝膠片段放在37℃ 10 uL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中過夜；
16. 加入50 uL 20mmol/L碳酸氫銨20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽；
17. 加入5%甲酸/50%乙腈20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽；
18. 如果需要用Speed Vac.濃縮多肽；
19. 用ZipTip脫鹽和純化多肽；
20. 如果需要用弱真空濃縮多肽至2 uL；
21. 加入基質進行質譜分析。
注意：根據細菌的生理和形態特征分類，產品來源為水解無色桿菌，但是最近細菌分類學將這種細菌鑒定為產酶溶桿菌。
保存：暗處-20℃保存
規格：20 ug×5vial
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賴氨酰肽鏈內切酶，MS級
產品編號：125-05061
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