JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

使用方法

使用方法

1. JC-1染色工作液的配制：

取適量JC-1 (200X)，按照每5µl +995 μl JC-1緩沖稀釋液（1X）的比例稀釋至1X JC-1染色工作液。

注：試劑盒標(biāo)配JC-1緩沖稀釋液為10X，使用前用三蒸水稀釋至1X使用，配置前應(yīng)于37℃水浴至室溫后方可使用，以免稀釋液過冷染色過程對細(xì)胞有刺激影響實驗結(jié)果，稀釋時將JC-1緩沖稀釋液（1X）快速加入到200X的JC-1母液中稀釋效果更佳。一般建議6孔板每孔使用JC-1染色工作液量為1ml，其它培養(yǎng)器皿用量以此類推。對于細(xì)胞懸液每5-10*10⁶細(xì)胞加0.5ml JC-1染色工作液（1X）。

2. 陽性對照組：

該試劑盒包含陽性對照CCCP（10 mM），CCCP可以誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位變化。使用方法：用細(xì)胞培養(yǎng)液配制CCCP，推薦終濃度為10 µM，對于不同細(xì)胞CCCP濃度可自行調(diào)整。正常條件下，10 µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會明顯改變，此時，JC-1染色后可觀察到明顯的綠色熒光；相反，正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后顯示紅色熒光。

3. 懸浮細(xì)胞處置：

a) 取5-10*10⁶細(xì)胞，用0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

b)加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20-30分鐘；不同細(xì)胞根據(jù)實驗可自行調(diào)整染色時間。

b) 孵育結(jié)束后，700g 4℃離心，收取沉淀細(xì)胞。

c) 用JC-1緩沖稀釋液（1X）洗滌2-3次：加入1 ml JC-1染色工作液重懸細(xì)胞，隨后用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用流式細(xì)胞儀分析。

4. 貼壁細(xì)胞處置：

a) 6孔板貼壁細(xì)胞處理過程如下：首先，棄培養(yǎng)液，用常溫PBS或培養(yǎng)液輕洗細(xì)胞2次，加入1 ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。陽性對照組中加入CCCP（終濃度10 µM）提前置于孵箱中處理20-30分鐘；

b) 隨后，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻。置于培養(yǎng)箱中37℃孵育30-60分鐘不等（可根據(jù)實驗情況調(diào)整）。

d)  孵育結(jié)束后，棄上清，用JC-1緩沖稀釋液（1X）洗滌細(xì)胞2次。

e)  加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 純化的線粒體：

a) 1 ml染色體系包含：0.9 ml JC-1染色工作液+0.1 ml純化的線粒體 (10-100µg)；置于37℃孵育20-30 分鐘，期間可上下顛倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育結(jié)束后，可用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：熒光分光光度計檢測：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為590 nm。熒光酶標(biāo)儀檢測時，激發(fā)波長可在475-520 nm范圍內(nèi)設(shè)置。具體可參考步驟6中的條件進(jìn)行熒光檢測。

c) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同步驟6。

6. 熒光檢測與數(shù)據(jù)分析：

JC-1單體的激發(fā)波為490 nm，發(fā)射光波長為530 nm；JC-1聚合物，激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm。實際測試過程中，可依據(jù)實驗室儀器的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，不必把激發(fā)和發(fā)射波長設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。熒光顯微鏡或共聚焦觀察時，JC-1單體的檢測可參照其它綠色熒光時的設(shè)置，如GFP或FITC通道；同理，JC-1聚合物的檢測時可以參考其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3的設(shè)置。因此，出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，我們可以通過比較紅綠熒光的相對比例衡量線粒體膜電位的變化。

注意事項

1.  JC-1 (200X)母液使用時需等待全部溶解后使用。

2. JC-1緩沖稀釋液使用時須0.2μm濾膜進(jìn)行無菌處理，以防微生物污染影響染色效果。

3. 洗滌時也可以用Hanks' Balanced Salt Solution、PBS等替代JC-1緩沖稀釋液。

附錄：

圖1. 使用本試劑盒檢測A549細(xì)胞在正常和造模前后的線粒體膜電位的實驗效果圖。

正常A549細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后以聚合物形式存在，呈明亮的紅色熒光，綠色熒光很弱；使用CCCP（10 μM）誘導(dǎo)使線粒體膜電位下降后，JC-1以單體存在形式居多，因此線粒體內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度顯著降低，而綠色熒光顯著增強(qiáng)。

4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5.本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

JC-1 (200X)母液需 -20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。JC-1緩沖稀釋液4℃保存，至少2周內(nèi)有效。