發光法支原體檢測試劑盒說明書

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產業鏈中的國產生物試劑品質關。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業，共同創世界優秀的中國生物制造企業，圓夢中國。

產品詳情

產品描述

《發光法支原體檢測試劑盒》通過檢測支原體含有的特異性 ATP 合成相關酶的活性以達到檢測體外培養的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的。

在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將 ADP 轉化成 ATP 的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產生光的反應需要 ATP 的參與，支原體特異性酶催化產生的 ATP 含量，可以通過該反應轉化成生物發光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專門的發光檢測儀（Luminometer）或具有發光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發光的強度與 ATP 的含量成正比。

具體的反應如下：通過比較細胞培養上清和未用于細胞培養而成分相同的培養液二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養的細胞是否被支原體污染。

產品特點

《發光法支原體檢測試劑盒》具有如下顯著的優點：

1. 檢測時間短。整個檢測過程只需 30 分鐘左右。

2. 《發光法支原體檢測試劑盒》檢測的是活支原體，只有樣品中存在活的支原體，才會生產陽性結果，可以區分支原體的死活。而《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都是檢測支原體的DNA，不論支原體的死活，樣品中只要有支原體DNA的存在，就會生產陽性結果，所以無法區分支原體的死活。細胞培養中，最關心的是細胞培養液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原體。而如果僅有死的支原體或者一些殘存的支原體 DNA，是無關緊要的。

3. 不存在假陽性。由于《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都需要對支原體 DNA 進行大量的擴增，檢測過程中，只要有微量的支原體 DNA 或者擴增產物的污染，就會出現假陽性。而《發光法支原體檢測試劑盒》只檢測活的支原體，不存在擴增產物污染樣品的問題。

4. 不存在因反應被抑制導致的假陰性。由于細胞培養數天后，培養液中經常含有嚴重抑制PCR擴增的代謝物， 所以使用《PCR 法支原體檢測試劑盒》經常會出現假陰性的問題。該問題在《發光法支原體檢測試劑盒》不存在。

5. 《發光法支原體檢測試劑盒》對支原體的識別率高：由于本試劑盒依賴的支原體特異性酶普遍存在，其具有廣譜的識別能力。

產品組分

（1） 支原體檢測溶液：5.5 mL

（2） 試劑 A(已凍干)：2.5 mL（50 次檢測）

（3） 試劑 B(已凍干): 2.5 mL（50 次檢測）

使用方法

使用方法

1. 檢測試劑的分裝和保存

收到的產品為凍干品，溶解前，請放-80 ℃冰箱低溫保存。第一次使用前，在冰上操作，分別用 2.5 mL 支原體檢測溶液溶解試劑 A 和試劑 B（注意：因為試劑 A 和試劑 B 的離心管容量不足 2.5 mL，可以分別先用 1 mL 支原體檢測溶液將凍干的試劑 A 和試劑 B 溶解后，轉移到一個 5 mL 或 10 mL 的離心管中，再各補加 1.5 mL 支原體檢測溶液）, 按每管 50 μL 分別分裝到 50 個 1.5 mL 離心管中，立即放-80 ℃冰箱低溫保存。

2. 陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照必須使用配制完后放于 4℃冰箱，未用于細胞培養但成分相同的培養液，包括其中的血清、抗生素等含量也必須相同。特別是其中的血清含量和批次，對發光的本底值影響很大，作為陰性對照的培養液，其中添加的血清，必須與用于細胞培養的血清批次相同且含量相同。例如：如果用于細胞培養的培養液為含有 10%的胎牛血清的高糖 DMEM，那么陰性對照也應該使用含有相同批次的 10%的胎牛血清的高糖 DMEM。如果用于細胞培養的培養液為無血清培養液，那么陰性對照也應該使用無

血清但成分相同的培養液。

上述陰性對照的選取是按照嚴格的方式進行的。如果確實沒有成分相同的培養液，也可以使用成分接近的培養液作為陰性對照。如果有些樣品實在沒有合適的陰性對照或者不知道樣品原來的培養基組成，可以嘗試使用含10%血清的 DMEM 培養基作為陰性對照。

3. 陽性對照的設置

如果您實驗室擁有經其他支原體檢測方法（比如本公司的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《PCR 法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》等）檢測為陽性的細胞系，其培養 3 天后的上清即可以直接按照后文的樣品準備方法，自己制備陽性對照。

如果您沒有上述陽性樣品，那么陽性對照也可以從我們公司單獨購買（貨號：LPC10）。如果第一次使用《發光法支原體檢測試劑盒》，建議購買一支本公司的《發光法支原體檢測試劑盒陽性對照》。

4. 待測樣品的準備

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品最好來源于至少培養 2-3 天且匯合度在 70-90% 左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長 2-3 天再取培養液進行檢測。具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：

（1）根據濃縮倍數，可以取 180-1500 μL 上述待測樣品到 1.5 mL 離心管內，在普通臺式離心機上 1000 rpm (大約 150 g)低速離心 5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內（注意：轉移離心上清時，請保留底部 60 μL 左右的液體，以防止將底部細胞沉淀吸走！），丟棄含細胞沉淀的原有離心管。

（2）將含有上清的新的 1.5 mL 離心管，在普通臺式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鐘， 沿離心管內壁離心時的內側面將離心后的上清小心緩慢全部吸走并丟棄（注意：勿讓吸頭碰到離心管內壁的底部 外側，因為底部外側可能含有支原體的沉淀?。Ｍx心管內，加入 120 μL 作為陰性對照的培養液。

（3）將上述經過離心清洗一次的樣品， 再次在普通臺式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鐘【離心時注意保持離心管放置的方向與上述步驟（2）相同】，同樣小心吸走 115 μL 離心后的上清并丟棄（注意：同樣勿讓吸頭碰到離心管內壁的底部外側。留下大約 5 μL 培養液的目的也是為了防止吸頭碰到離心管底部外側而將可能含有支原體的沉淀吸走）。往離心管內，加入 115 μL 作為陰性對照的培養液（此時，總體積仍然為 120 μL）。

（4）將上述經過離心清洗兩次的樣品，用移液槍上下吹吸 10-20 次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻。至此，該樣品方可用于后續的支原體檢測（夠兩次檢測使用）。

（5）吸取 50 μL 陰性對照、陽性對照或者已經經過低速離心去除細胞和經過高速離心替換成陰性對照的培養液的待測樣品，放入黑色（優先選擇）或者白色不透明的 96 孔板內，加入 50 μL 冰上放置的試劑 A，室溫反應 15 分鐘。

（6）室溫反應 15 分鐘后，加入 50 μL 冰上放置的試劑 B，無需等待，立即在具有發光檢測功能的多功能酶標儀或者單獨的發光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發光檢測參數進行發光值的檢測，5 分鐘內，連續測 5 次陰性對照和待測樣品的發光值，計算各自的平均值。

注意事項

1、 本試劑盒只在 96 孔板進行過測試。因為發光值會隨時間略有變化，如果使用單管的發光檢測儀，盡量保證陰性對照和待測樣品加入試劑 A 后的反應時間和加入試劑 B 后到發光值檢測的反應時間相同。

2、 問：如果配制完后放于 4℃冰箱未用于細胞培養且成分相同的培養液本身有支原體污染（比如加入的血清本身含支原體），是否仍然可以用作陰性對照？

答：可以。因為：即使作為陰性對照的培養液本身有支原體污染，其中的含量也是極其微量的。而待測樣品是經過培養 3 天以上的，其支原體在這 3 天培養過程中，會大量繁殖，用《發光法支原體檢測試劑盒》檢測的發光值，肯定比陰性對照的發光值高得多。