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點突變試劑盒1.0說明書

更新時間:2023-06-05      點擊次數(shù):2337

點突變試劑盒1.0說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司(Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.)屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司(2009年成立)旗下的子公司,成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌,打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時,把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè),共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè),圓夢中國。

產(chǎn)品詳情  

貨號

規(guī)格

價格

78BDA10006-10次

10次

560.00

78BDA10006-20次

20次

896.00

78BDA10006-50次

50次

1820.00

產(chǎn)品描述

本試劑盒可以在質(zhì)粒DNA序列中任意位點引入特定的定突變,包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

首先用高保真DNA聚合酶與帶有突變堿基與硫代修飾的引物,PCR擴增野生型質(zhì)粒,將質(zhì)粒線性化并引入突變位點,然后用化學重組試劑將質(zhì)粒重組成環(huán)狀質(zhì)粒。擴增質(zhì)粒的一對引物各自5'末端的10-12個堿基互補配對,用于重組環(huán)化質(zhì)粒。將帶有突變堿基的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物用化學重組試劑處理環(huán)化質(zhì)粒,然后進行DH5a轉(zhuǎn)化,完成基因定點突變。

本公司化學法突變試劑盒含有高保真DNA聚合酶2XPCR Mix、化學重組試劑,可以從頭到尾完成整個實驗,極大的方便了實驗操作。另有無高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化學法突變試劑盒。

產(chǎn)品特點

DNA定點突變,包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

產(chǎn)品組分

組分

78BDA10004

78BDA10004

78BDA10004

2×PCR Mix

250 μl

500 μl

1250 μl

化學重組試劑

20 μl

40 μl

100ul

10X化學重組buffer

20 μl

40 μl

100ul

突變線性質(zhì)粒DNA

50ul

100ul

250ul

使用方法

使用方法

01. 設(shè)計突變引物

引物設(shè)計總原則:在正反向擴增引物的5'端引入末端互補同源序列,使擴增后的線性化質(zhì)粒片段5'3'末端帶有10-12個堿基的同源序列,用于重組環(huán)化質(zhì)粒。

正向擴增引物設(shè)計原則:5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性正向配對序列-3'

反向擴增引物設(shè)計原則:5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性反向配對序列-3'

正/反向擴增引物與質(zhì)粒模板的特異性配對序列Tm55-65℃為佳,末端同源區(qū)序列長度為10-12 個堿基(一般情況同源區(qū)10個堿基足以)。

一般引物不需PAGE純化,如果最終引物長度超過40 bp,推薦合成時選用PAGE純化,有助于提高PCR與點突變成功率。

02. 反向PCR擴增線性化質(zhì)粒,并引入突變位點

為了防止突變位點之外的堿基額外突變,確保使用高保真聚合酶進行反向PCR50ulPCR體系中,推薦使用1-5ng 環(huán)狀質(zhì)粒模板。限制性內(nèi)切酶DpnI處理PCR產(chǎn)物,可以降低野生型質(zhì)粒形成的克隆數(shù)。由于本突變試劑盒效率高,可省略DpnI消化處理,對突變成功率影響不大。

03. 重組環(huán)化反應(yīng)的線性化質(zhì)粒使用量

無需精確計算化學法重組反應(yīng)的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物加入量,一般使用3-5ul

04. 質(zhì)粒重組環(huán)化反應(yīng)

1)室溫配制以下反應(yīng)體系:

組分            重組反應(yīng)a     陰性對照b       陽性對照c

線性化質(zhì)粒       X μl           X μl              5 μl

化學重組試劑     2 μl           0 μl              2 μl

ddH20         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割膠純化的PCR產(chǎn)物進行重組反應(yīng)時,一定在重組反應(yīng)體系中加入1/10體積的化學重組Buffer

b. 用來確認野生型環(huán)狀質(zhì)粒殘留,推薦進行。

c. 突變線性質(zhì)粒DNA陽性對照反應(yīng)可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響。

2)輕柔混勻后,在70℃反應(yīng)8-10 min,置于室溫或冰上冷卻。

PCR儀及其它加熱儀器上進行反應(yīng),重組環(huán)化效率在反應(yīng)8-10 min左右達到最高。

重組環(huán)化產(chǎn)物可于-20℃存放1個月,待需要時解凍轉(zhuǎn)化即可。

05.重組環(huán)化質(zhì)粒產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞,冰上放置15min

5ul重組環(huán)化產(chǎn)物加入到50ul感受態(tài)細胞中,輕彈管壁混勻(請勿振蕩混勻),冰上靜置15-20 min重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細胞體積的1/5

42℃水浴熱激1-2min后,立即置于冰上冷卻1- 2 min

加入450 μl SOCLB培養(yǎng)基(不添加抗生素)37℃搖菌30min-1h (轉(zhuǎn)速200 - 250 rpm)

將相應(yīng)抗性的LB平板固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱30min(可省略)。

直接吸取20-100ul菌液到含有正確抗性的平板上,用無菌涂布棒涂勻。

37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 - 16 h

06.點突變測序鑒定

過夜培養(yǎng)后,重組環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上形成數(shù)百個單克隆,而不加化學重組試劑的陰性對照反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上的克隆數(shù)應(yīng)顯著少于前者。

挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上2-3個克隆進行DNA序列測定,驗證是否突變成功。

注意事項

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作!

本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

干冰運輸。-20℃保存,有效期2年。


上海起發(fā)實驗試劑有限公司
地址:上海浦東川沙鎮(zhèn)川沙路6619號上海起發(fā)實驗試劑有限公司
郵箱:xs1@78bio.com
傳真:021-50724961
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