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單克隆抗體的基本原理和過程

更新時間:2011-12-17      點擊次數(shù):8214

 

單克隆抗體的基本原理和過程
 
     通過細胞融合技術將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合,所產(chǎn)生的融合細胞既具有親本骨髓瘤細胞的無限繁殖的生物學特性,又具有另一親本B淋巴細胞合成、分泌特異性抗體的能力。應用此技術從一個抗體分泌性B細胞雜交瘤分裂增殖,形成一個大的細胞克隆。由B細胞雜交瘤細胞克隆產(chǎn)生的只識別抗原分子上某一個抗原決定簇的純抗體,即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強、利于實驗標準化即可大量生產(chǎn)供應等特點。
    在單克隆抗體制備中,雖然除小鼠外其它動物也可用于制備雜交瘤,但本書以小鼠為例來說明有關技術,同樣的技術也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對特殊動物之間或與人細胞的融合,也有簡要說明。
單克隆抗體的制備是一個復雜、精細的工藝過程。為對全過程有一個概括的了解,先用表1 列出mAbs制備過程中的各個階段。一般將全過程分為三個階段:(1)免疫小鼠;(2)建立篩選方法和程序;及(3)雜交瘤生成。 
1  雜交瘤細胞生成的各個階段和所需時間

 
動物免
疫階段
 
初始免疫
兩周
 
一個月到一年
10天
強化免疫
血清測試
 
 
方法建
立階段
 
篩選方法的建立與測試
 
 
zui少
兩周
 
大約一個月
zui后一次強化免疫
 
 
 
 
 
 
 
雜交瘤細胞生成階段
 
大約
一周
細胞融合
 
 
 
 
 
 
 
 
大約一個月
篩選陽性克隆
 
 
 
 
 
 
 
 
 陽性克隆擴增及凍存
 
 
 
大約
一周
單細胞的克隆生長
 
 
     選
部分陽性細胞擴增*
大部凍存(保留zui后所得的雜交瘤細胞)

  *得到擴增的陽性雜交瘤細胞后,可從其培養(yǎng)液中收集含單克隆抗體的上清液,進行鑒定(其抗體含量為10-50µg/ml);
  *雜交瘤細胞也可進行小鼠腹腔注射,以產(chǎn)生Mab含量高的腹水(其抗體含量為1-10mg/ml)。            
     以上每一階段都有可能迅速順利完成,但各階段也都有其本身的問題,需在實驗開始前予以充分考慮,以免影響全局。以下分別進行討論。動物在注入抗原后,一旦出現(xiàn)良好的體液免疫應答,同時又已建立合用的篩選方法,并通過血清對所建立篩選方法進行評價、確定方法后,才可開始雜交瘤細胞的制備。其過程大致為:在細胞融合前數(shù)日,用抗原免疫動物;將從免疫動物得到的分泌抗體的細胞與骨髓瘤細胞相混,進行細胞融合(有效的細胞融合約可得1/105存活的雜交細胞);其后,將融合細胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋,置多孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。在細胞融合后一周,即可對雜交瘤進行測試,從陽性培養(yǎng)孔所取的細胞先增殖,然后,進行克隆化(即單克隆生長),雜交瘤的生成與克隆需要時間,很少的實例只需要兩個月,有的甚至要一年時間。因制備mAbs 過程中的每一步都對其后各步影響很大,因此均需注意選擇zui適宜的條件,如:
l         要注意抗原的選擇及其性質,如細胞、蛋白質、半抗原等;
l         根據(jù)抗原得性質和得量和對抗體得要求等,計劃及建立免疫的途徑和方式;
l         選定篩選的方法:抗體篩選的測試方法必須簡單、可重復、特異,并可適用于mAb的zui終使用(即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗等中的應用);
l         要確定細胞培養(yǎng)的條件;
l         進行細胞融合的方式:包括雜交方法和細胞的選擇,和克隆的方式(限制性稀釋或軟膠法)等。
   典型的單克隆抗體的制備過程為:
1. *次對每一小鼠注射500µl抗原與*福氏佐劑1:1的混和液(ip)。 共注6支BALB/c雌性小鼠(抗體的實際需用量見表2);
2.14天后,再次注射,但改用抗原與不*福氏佐劑混合液;
3.24天,從免疫小鼠尾靜脈取血,血清經(jīng)PBS 1:5稀釋,以同樣稀釋的正常血清為對照,用點雜交(Dot blot)法進行測定;
4.35天,所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不*福氏佐劑混合液;
5.45天,取尾靜脈血,用點雜交法再次檢測。所有血清樣品均通過與在體同位素標記的抗原進行免疫沉淀法檢測;
6.56天,對免疫應答的小鼠再靜脈注射100µl 及腹腔注視100µl不*福氏佐劑抗原混合液,而對所有其余小鼠僅腹腔注射不*福氏佐劑抗原混合液;
7.59天由免疫應答的小鼠取脾細胞進行細胞融合;
8.66天,開始艱巨的工作,尋找*個陽性克隆的篩選。
*具體免疫抗原用量參見表2。 
2 抗原的參考用量

抗原類型
      例
初次免疫及加強免疫
zui后加強免疫
 
 
抗原的劑量與方式
抗原的劑量與方式
可溶性蛋白
酶、多肽與載體蛋白
復合物、免疫復合物
5-50µg,+佐劑,ip或sc
5-50µg, -佐劑,iv
顆粒性蛋白
已殺死的病毒或酵母
或細菌,結構蛋白
5-50µg,+佐劑,ip或sc
5-50µg, -佐劑,iv
不溶性蛋白
細菌包含體的產(chǎn)物
與固相小球結合的
經(jīng)免疫純化蛋白
5-50µg,+佐劑,ip或sc
5-50µg, -佐劑,ip
活 細 胞
哺乳動物細胞 
105-107 細胞—佐劑,ip
106 細胞, -佐劑,iv
活癌源細胞
哺乳動物癌源細胞
104-106 細胞—佐劑,ip
106 細胞, -佐劑,iv
   類
多糖、糖蛋白
5-50µg,+/-佐劑,ip或sc
5-50µg, -佐劑,iv
   酸
核酸與載體蛋白復合物
5-50µg,+佐劑,ip
5-50µg, -佐劑,iv

ip 腹腔注射; sc 皮下注射;iv 靜脈注射 
人員要求和儀器設備 
   雜交瘤得制備需要優(yōu)良的組織培養(yǎng)設備及訓練有素、有經(jīng)驗的專門技術人員。
   培養(yǎng)雜交瘤及有關細胞所需設備有:
l         有專門空氣過濾裝置的細胞培養(yǎng)場所
l         有關實驗動物所需條件
l         免疫用注視器和針頭
l         通風櫥
l         濕度維持5-8%、37℃的CO2 孵箱
l         倒置顯微鏡(具有×10及 ×20物鏡,× 10-15 目鏡)
l         用于細胞記數(shù)的光學顯微鏡
l         紅細胞記數(shù)器
l         37℃水浴
l         洗細胞用低溫離心機
l         一次性塑料培養(yǎng)板(24孔和96孔)及培養(yǎng)瓶
l         15及50ml 消毒的聚丙烯錐形管
l         消毒1,2,5及10 ml 的吸管及吸液器
l         低溫冰箱(–80℃)及液氮罐  
參考文獻 
1.Galfre, G. And Milstein, C. (1981) Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedure. Methods in Enzymology. 73,3-46
2.瘤技術與單克隆抗體制備”  見巴德年主編 《當代免疫學技術與應用》pp.351-373 北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社 1998。
3.胞融合雜交及單克隆抗體技術”  見楊景山主編《醫(yī)學細胞化學與細胞生物學技》pp.452-469北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社  1992 。
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