一、 產(chǎn)品基礎(chǔ)信息描述

本說明書針對的產(chǎn)品為 Qiagen 品牌旗下的經(jīng)典分子生物學(xué)提取試劑盒——DNeasy Blood & Tissue Kit。該產(chǎn)品在國際生物科研領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于各類動物源性樣本的基因組DNA提取。

•   產(chǎn)品英文全稱：DNeasy Blood & Tissue Kit

•   產(chǎn)品中文譯名：DNeasy 血液與組織DNA提取試劑盒

•   國際貨號 (Cat. No.)：69506

•   品牌歸屬：Qiagen (凱杰)

•   核心規(guī)格：標(biāo)準(zhǔn)版提供50次或250次樣本提取體系 (以250次為例，貨號69506)

•   提取技術(shù)：基于硅膠膜離心柱技術(shù) (Silica-Membrane Spin-Column Technology)

•   樣本兼容性：專為動物血液、新鮮/冷凍動物組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌 (革蘭氏陽性/陰性)、昆蟲及毛發(fā)等特殊樣本優(yōu)化

•   下游應(yīng)用驗證：成功應(yīng)用于常規(guī)PCR、多重PCR (Multiplex PCR)、熒光定量PCR (qPCR)、數(shù)字PCR (dPCR) 以及新一代測序 (NGS)

此試劑盒提供了一種快速、便捷且無需使用酚氯仿等有毒有機(jī)試劑的DNA提取方案。其核心優(yōu)勢在于通過蛋白酶K在優(yōu)化的裂解緩沖液中直接裂解樣本，繞過了傳統(tǒng)的機(jī)械破碎步驟，極大地縮短了手動操作時間并降低了氣溶膠污染的風(fēng)險。此外，整個提取流程高度契合Qiagen QIAcube Connect自動化平臺，可實現(xiàn)從樣本裂解到DNA洗脫的全自動化操作，滿足現(xiàn)代實驗室對高通量與標(biāo)準(zhǔn)化的嚴(yán)苛需求。

二、 產(chǎn)品核心特點與技術(shù)優(yōu)勢

1. 操作簡潔且高度優(yōu)化：對于絕大多數(shù)動物組織及血液樣本，該試劑盒僅需加入蛋白酶K與特定緩沖液，在56℃條件下孵育即可完成裂解。這種酶解主導(dǎo)的裂解方式避免了使用勻漿儀或液氮研磨帶來的樣本間交叉污染風(fēng)險，尤其適合大批量臨床或獸醫(yī)樣本的快速前處理。

2. 廣泛的樣本普適性：無論是高含量的肝臟組織，還是富含膠原蛋白的皮膚、肌腱，亦或是極難裂解的革蘭氏陽性菌和真菌細(xì)胞壁，該試劑盒均提供了經(jīng)過驗證的標(biāo)準(zhǔn)化或補(bǔ)充操作方案，確保從不同生物學(xué)材料中均能穩(wěn)定獲取高質(zhì)量基因組DNA。

3. 抑制劑去除能力：試劑盒內(nèi)置的專屬緩沖液體系與洗滌步驟，能有效去除樣本中的多糖、蛋白及PCR反應(yīng)抑制因子。提取出的DNA純度高，無需額外純化步驟即可直接作為模板用于各類下游酶學(xué)反應(yīng)。

4. 靈活的通量適配性：除了常規(guī)的單次樣本離心柱操作，該系列還提供DNeasy 96 Blood & Tissue Kit版本，配合Qiagen 96孔板離心系統(tǒng)，可一次性處理96至192個樣本，契合藥物篩選或群體遺傳學(xué)的高通量需求。

5. 環(huán)保升級選項的兼容性：雖然本貨號 (69506) 為標(biāo)準(zhǔn)版，但值得一提的是，Qiagen同期推出了QIAwave DNA Blood & Tissue Kit作為可持續(xù)替代方案。QIAwave版本在保持與本產(chǎn)品全一致的化學(xué)成分與提取性能的前提下，大幅減少了塑料與紙板的消耗。這展現(xiàn)了該提取技術(shù)體系的成熟與環(huán)保潛力。

三、 工作原理的深度科學(xué)解析

DNeasy Blood & Tissue Kit 的核心提取機(jī)制建立在高離液鹽 (Chaotropic salts) 存在下的硅膠膜特異性吸附技術(shù)之上。這一物理化學(xué)過程高效且具選擇性。

1. 細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)消化：在含有高濃度異硫氰酸胍 (Guanidine thiocyanate) 等離液劑的裂解緩沖液中，細(xì)胞或細(xì)菌壁被迅速破壞，釋放出內(nèi)部的核酸分子。同時，加入的蛋白酶K (Proteinase K) 在還原劑存在的環(huán)境下，能夠迅速切斷組蛋白與核酸之間的結(jié)合，并將大部分蛋白質(zhì)降解為小肽段或氨基酸。

2. 核酸的選擇性吸附：當(dāng)溶液中的離液鹽濃度達(dá)到臨界值時，水分子會被高濃度的鹽離子所占據(jù)（即脫水作用）。此時，呈負(fù)電的DNA磷酸骨架暴露出來，與硅膠膜上帶正電荷的官能團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的靜電相互作用，從而使DNA被牢固地吸附在離心柱的硅膠膜上。

3. 嚴(yán)格的雜質(zhì)清洗階段：在DNA結(jié)合后，通過短暫的離心，含有細(xì)胞碎片、多糖、代謝廢物及有機(jī)溶劑的廢液被甩入收集管底部。隨后加入的洗滌緩沖液I和II，進(jìn)一步在高鹽環(huán)境下清除硅膠膜上殘留的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及其他細(xì)胞代謝物，確保最終的DNA產(chǎn)物純凈無污染。

4. 低鹽環(huán)境下的溫和洗脫：最后一步，使用低鹽或無鹽的洗脫緩沖液 (如Buffer AE或無菌水) 平衡硅膠膜的電荷環(huán)境，中和靜電引力，從而使吸附在膜上的純凈基因組DNA重新溶解在洗脫液中，便于后續(xù)實驗取用。

四、 解決的實驗痛點與實際應(yīng)用場景

在日常的分子生物學(xué)、獸醫(yī)病理學(xué)及轉(zhuǎn)基因動物研究中，科研人員常常面臨諸多棘手的樣本處理難題，而本產(chǎn)品正是為了解決以下核心痛點而設(shè)計的：

1. 解決了微量及非標(biāo)準(zhǔn)樣本的提取困境

  在進(jìn)行大型家畜（如豬、牛）的基因分型或野生動物（如馬匹）的系譜鑒定時，往往只能獲取到極少量的樣本（如一根毛發(fā)、少許干燥血液斑點或微量皮膚活檢組織）。本試劑盒憑借其高靈敏度的載體DNA可選添加方案及高效的微量核酸回收技術(shù)，能夠從這些“非標(biāo)準(zhǔn)"樣本中提取出足以為下游基因分型提供可靠數(shù)據(jù)的基因組DNA。

2. 攻克了高難度樣本的裂解壁壘

  某些特殊樣本（如昆蟲外骨骼、酵母細(xì)胞壁、某些頑固的革蘭氏陽性菌）具有極其堅韌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，常規(guī)的SDS裂解或堿裂解法難以奏效。該試劑盒通過提供特定的補(bǔ)充操作方案（如延長蛋白酶K孵育時間、調(diào)整離液鹽濃度），在不依賴昂貴機(jī)械破壁設(shè)備的前提下，實現(xiàn)了對這些硬核樣本的充分酶解。

3. 消除了復(fù)雜樣本中的PCR抑制效應(yīng)

  在轉(zhuǎn)基因小鼠的常規(guī)實驗室分析或肉類加工食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測中，樣本常含有大量的血紅素、膠原蛋白、多糖或食品防腐劑，這些物質(zhì)會嚴(yán)重抑制Taq DNA聚合酶的活性。本試劑盒的多步洗滌緩沖液系統(tǒng)能針對性地去除這些抑制因子，提取出的DNA即使在多重?zé)晒舛縋CR中也能展現(xiàn)出佳的反應(yīng)曲線。

4. 滿足了食品安全與成分鑒定的合規(guī)需求

  針對植物性食品（如大豆、豆腐、餅干）或深加工肉制品（如香腸、巧克力），該試劑盒可與Qiagen其他專用試劑盒互補(bǔ)，為食品中的外源基因（如Roundup Ready Soybean和MON810 Maize）檢測提供合格的模板DNA，助力食品安全的合規(guī)篩查。

五、 詳細(xì)實驗操作流程 (以標(biāo)準(zhǔn)動物血液/組織為例)

為了確保每一次提取都能獲得穩(wěn)定、高質(zhì)量的DNA，請務(wù)必嚴(yán)格按照以下步驟進(jìn)行操作。實驗前，請確保所有緩沖液已達(dá)到室溫，并在Buffer AW1和AW2中加入指定體積的乙醇。

第一步：樣本的預(yù)處理與裂解

•   動物組織：取25-30 mg新鮮或冷凍的組織塊。為避免DNA剪切，請勿使用高速勻漿機(jī)。直接將組織塊放入1.5 ml離心管中，加入180 µl Buffer ATL和20 µl Proteinase K (10 mg/ml)，渦旋混勻。

•   動物全血：取20-100 µl抗凝血，加入180 µl Buffer ATL和20 µl Proteinase K，充分混勻。

•   孵育裂解：將離心管置于56℃水浴箱中孵育。對于軟組織（如肝臟、脾臟），通常1-3小時即可全消化；對于硬組織（如皮膚、肌肉）或血液中白細(xì)胞沉淀，建議延長孵育時間至 overnight（過夜），期間可輕輕振蕩混勻以加速裂解。

第二步：調(diào)整結(jié)合條件與上柱

•   裂解全后，短暫離心將管蓋上的液滴甩下。加入200 µl Buffer AL，渦旋15秒使其與裂解液充分混合。此時溶液應(yīng)變得清亮。

•   加入200 µl無水乙醇 (Ethanol)，再次渦旋混勻。此時可能會出現(xiàn)白色沉淀，屬正常現(xiàn)象。

•   將DNeasy Mini離心柱放入收集管中，將樣本-緩沖液混合液全部轉(zhuǎn)移至離心柱內(nèi)（若體積過大，可分兩次轉(zhuǎn)移）。

•   12000 rpm (~13400 x g) 離心1分鐘。將流出液倒入廢液缸，再將離心柱放回收集管。

第三步：雜質(zhì)洗滌與去除

•   向離心柱內(nèi)加入500 µl Buffer AW1。12000 rpm 離心1分鐘，棄去收集管底部的廢液。

•   向離心柱內(nèi)加入500 µl Buffer AW2。13000 rpm (~17900 x g) 離心3分鐘，這一步的目的是去除殘留的乙醇和鹽離子。

•   關(guān)鍵提示：為防止乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)酶切或PCR反應(yīng)，建議將離心柱開蓋，在室溫下靜置5-10分鐘，使硅膠膜全干燥。

第四步：DNA的洗脫與保存

•   將離心柱轉(zhuǎn)移至一個新的1.5 ml干凈離心管中。

•   向硅膠膜中央懸空滴加50-200 µl 預(yù)熱至55℃的Buffer AE或無菌蒸餾水。室溫靜置1-5分鐘，讓DNA充分溶解。

•   12000 rpm 離心1分鐘，管底即為提取完成的基因組DNA。

•   提取的DNA可立即用于下游實驗，或于-20℃/-80℃長期保存。

六、 針對不同樣本類型的專項優(yōu)化建議

為了幫助您應(yīng)對更復(fù)雜的實驗材料，以下是基于大量實驗數(shù)據(jù)總結(jié)的特殊樣本處理建議：

1. 細(xì)菌樣本 (革蘭氏陽性/陰性菌)

  在處理細(xì)菌時，預(yù)期得率約為每2x10^9個細(xì)胞提取10 µg基因組DNA。由于細(xì)菌細(xì)胞壁的堅韌程度差異巨大，對于革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌、鏈球菌），建議在Buffer ATL中加入蛋白酶K后，適當(dāng)提高孵育溫度至70℃并延長消化時間；或者在56℃過夜孵育后，補(bǔ)加一次蛋白酶K繼續(xù)消化，這能顯著提升破壁效率及最終的DNA得率。

2. 酵母與真菌樣本

  酵母細(xì)胞壁含有大量幾丁質(zhì)和葡聚糖，常規(guī)蛋白酶K難以快速穿透。針對此類樣本，請務(wù)必參照本產(chǎn)品專門的補(bǔ)充操作方案《Purification of total DNA from yeast using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY13)。通常需要預(yù)先使用機(jī)械力（如玻璃珠震蕩破碎）或加入特定的破壁酶（如Lyticase）進(jìn)行預(yù)處理，然后再銜接標(biāo)準(zhǔn)的DNeasy提取流程。

3. 昆蟲樣本

  昆蟲的硬殼和外骨骼極易在提取過程中引入大量的幾丁質(zhì)和黑色素，這些物質(zhì)具有強(qiáng)烈的PCR抑制效應(yīng)。請遵循專門的補(bǔ)充方案《Purification of total DNA from insects using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY14)。在裂解階段，增加蛋白酶K的用量并延長孵育時間至過夜是確保充分消化的關(guān)鍵。同時，在洗滌步驟中確保Buffer AW2去除殘留的雜質(zhì)。

4. 微量與痕量樣本 (如單根毛發(fā)、唾液、粗提裂解液)

  當(dāng)處理預(yù)期DNA含量低于10 ng的微量樣本時，強(qiáng)烈建議在裂解或結(jié)合步驟中加入載體DNA（如poly-dA、poly-dT或鯡魚精DNA），其終濃度應(yīng)不低于10 µg/ml。這能為微量核酸提供結(jié)合位點，防止其在純化過程中因吸附損耗而丟失。但需注意，若后續(xù)實驗涉及寡核苷酸引物（如oligo-dT）的使用，則不能使用poly-dA作為載體，以免引發(fā)非特異性結(jié)合干擾實驗結(jié)果。

5. 植物細(xì)胞與食品基質(zhì)

  雖然本試劑盒主要針對動物樣本優(yōu)化，但在處理轉(zhuǎn)基因大豆、玉米或深加工食品（如巧克力、香腸）時同樣表現(xiàn)優(yōu)異。對于富含多糖的植物組織，可參考《Purification of total DNA from crude lysates using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY15) 方案，即先使用SDS或CTAB法自行裂解植物樣本，去除多糖和次生代謝物后，取上清液接入DNeasy流程進(jìn)行硅膠膜純化。

七、 下游應(yīng)用表現(xiàn)與核酸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

提取的基因組DNA質(zhì)量直接決定了后續(xù)分子生物學(xué)實驗的成敗。使用DNeasy Blood & Tissue Kit提取的DNA，在各項下游應(yīng)用中均展現(xiàn)出高度的可靠性：

1. PCR與多重PCR應(yīng)用

  提取的DNA不含血紅素或其他蛋白酶抑制劑，能夠作為理想的模板用于標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增。在需要同時擴(kuò)增多個位點的高效16重PCR體系中，使用該試劑盒提取的模板依然能夠支持所有靶點呈現(xiàn)出均勻、清晰的擴(kuò)增條帶，無明顯的偏好性或抑制現(xiàn)象。

2. 熒光定量PCR (qPCR) 與數(shù)字PCR (dPCR)

  在需要高靈敏度和精準(zhǔn)定量的應(yīng)用中（如轉(zhuǎn)基因小鼠的拷貝數(shù)分析、病原載量測定），DNA的純度至關(guān)重要。該試劑盒提取的DNA在qPCR中展現(xiàn)出極低的Ct值背景噪音和擴(kuò)增效率曲線。同時，其也全兼容高靈敏度的dPCR和NGS建庫需求。

3. 濃度測定與質(zhì)控建議

  •   光譜光度法：使用NanoDrop等分光光度計檢測時，純的基因組DNA在260 nm處有吸收峰，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，A260/A230應(yīng)大于2.0。

  •   熒光定量法：對于低濃度樣本（如毛發(fā)或微量血），分光光度計往往無法給出準(zhǔn)確數(shù)值。此時，推薦使用PicoGreen等DNA特異性熒光染料進(jìn)行定量，該方法靈敏度高，可準(zhǔn)確測定pg級別的核酸。

  •   完整性檢測：通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，完整的基因組DNA應(yīng)呈現(xiàn)一條位于膠孔附近的高分子量條帶。若發(fā)生降解，會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

八、 常見問題排查與解決方案 (Troubleshooting)

在實驗過程中遇到問題時，請參考以下排查指南進(jìn)行優(yōu)化：

1.如果遇到 DNA 得率極低或無 DNA 的情況，可能的原因包括樣本未充分裂解、乙醇忘記加入 Buffer AW1/AW2 導(dǎo)致結(jié)合失敗、洗脫體積過小或 pH 值不當(dāng)、以及微量樣本未發(fā)生載體 DNA 沉淀。對應(yīng)的解決方案為：延長蛋白酶 K 孵育時間，或提前液氮研磨以增加接觸面積；檢查洗滌緩沖液配制過程，確保加入了正確體積的乙醇；使用 pH 7.5-8.0 的 Buffer AE 洗脫，可適當(dāng)加熱至 55℃ 以促進(jìn)溶解；在微量樣本中加入 poly-dA 等載體 DNA 輔助沉淀。

2.如果 DNA 純度差，導(dǎo)致 PCR 無擴(kuò)增，這通常是因為洗滌不充分導(dǎo)致蛋白酶 K 殘留，或者乙醇?xì)埩粢种屏?Taq 酶活性，也可能是樣本本身含有多糖或色素抑制劑。建議嚴(yán)格按規(guī)程加入 Buffer AW1 和 AW2，并執(zhí)行高轉(zhuǎn)速離心；增加一次無水乙醇洗滌步驟，或延長離心柱干燥時間；針對特殊樣本參考補(bǔ)充方案，必要時增加苯酚/氯仿抽提前處理步驟。

3.如果 DNA 在洗脫液中不溶解或呈粘稠狀，可能是因為洗脫緩沖液體積過少，或者基因組 DNA 分子量過大發(fā)生剪切困難。建議增加洗脫緩沖液體積至 100-200 µl。洗脫時置于 55℃ 水浴 1-2 小時并輕柔搖晃，切勿劇烈震蕩，以免造成 DNA 斷裂。

4.如果 A260/A230 比值過低（小于 1.8），表明離液鹽或乙醇未洗凈，或者樣本中含有較多多糖或蛋白雜質(zhì)。應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行 Buffer AW2 的高轉(zhuǎn)速 (13000 rpm) 離心步驟；樣本裂解后，可先 8000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液進(jìn)行過柱操作，以去除不溶性雜質(zhì)。

九、 試劑組分、儲存條件與實驗室安全規(guī)范

1. 試劑盒組成 (以50次規(guī)格為例)

  貨號69506試劑盒通常包含：DNeasy Mini離心柱 (50個)、2 ml收集管 (50個)、Buffer ATL (50 ml)、Buffer AL (50 ml)、Buffer AW1 (15 ml，使用前按指示加乙醇)、Buffer AW2 (18 ml，使用前按指示加乙醇)、Buffer AE (15 ml)、蛋白酶K (10 mg/ml, 1.5 ml)。

2. 儲存與保質(zhì)期

  •   蛋白酶K (Proteinase K)：收貨后可室溫穩(wěn)定保存1年。為延長其活性壽命，建議儲存于2-8℃。

  •   其他緩沖液 (Buffer ATL, AL, AW1, AW2, AE)：室溫 (15-25℃) 密封儲存。一旦開啟，建議在1年內(nèi)使用完畢以保證最佳效果。

  •   DNeasy Mini離心柱：室溫干燥避光保存。

3. 廢液處理與實驗室安全

  •   本試劑盒中的裂解液和結(jié)合緩沖液含有異硫氰酸胍等離液鹽成分，具有一定的生物滅活能力，可降解部分有害生物材料。

  •   所有接觸過生物樣本的廢液（特別是含有離液鹽和蛋白酶K的廢液）絕對不能直接與漂白劑或酸性溶液混合，否則會產(chǎn)生劇毒的氣體。

  •   實驗過程中產(chǎn)生的固體廢物（如Tip頭、離心管），以及未處理完的生物樣本殘渣，必須根據(jù)您所在機(jī)構(gòu)的生物危害廢物處置指南進(jìn)行分類和高壓滅菌處理。

  •   操作全程請穿戴實驗服、佩戴防護(hù)手套和護(hù)目鏡，在通風(fēng)櫥內(nèi)處理揮發(fā)性試劑。

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